Esposizione a dosaggi subletali di Fipronil e Thiacloprid aumenta altamente la mortalità di api infettate precedentemente da Nosema ceranae
Cyril Vidau1,2, Marie Diogon1,2, Julie Aufauvre1,2, Régis Fontbonne1,2, Bernard Viguès1,2, Jean-Luc Brunet3, Catherine Texier2, David G. Biron1,2, Nicolas Blot1,2, Hicham El Alaoui1,2, Luc P. Belzunces3, Frédéric Delbac1,2*
http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0021550
Introduzione
Una consistente e scarsamente capita scomparsa di alveari è riportata da apicoltori e ricercatori . Diversi elementi sono stati proposti come elemento di spiegazione dei problemi delle api , inclusi nutrizione,qualità delle regine,intossicazione da pesticidi e malattie parassitarie [2].
Apis mellifera (Hymenoptera, Apoidea),è esposta ad una gamma di pesticidi nel corso dell’attività di bottinamento o mangiando cibo contaminato (polline e miele) immagazzinati nell’alveare [3].Due classi di pesticidi sistemici , neonicotinoidi e fenilpirazoli sono sospettati di avere effetti negativi sulle api .Vi è un acceso dibattito relativamente all’uso e ad eventuali restrizioni di questi pesticidi. In molti studi , la mancanza di conoscenze relativamente al loro profilo tossicologico ha impedito di raggiungere solide conclusioni relativamente ad una relazione tra esposizione agli insetticidi e problemi delle api [4].Questo è parzialmente dovuto al fatto che le prove di rischio relative ad un pesticida sono principalmente basate sulla valutazione della tossicità acuta usando la LD50 come valore tossicologico critico. [5].
Questo metodo è contestato perchè non tiene conto della tossicità cronica e degli effetti subletali, i quali sono elementi importanti della tossicità per le api di neonicotinoidi e fenilpirazoli[6]–[8]. Sicuramente basse quantità di neonicotinoidi e fenilpirazoli inducono un’ampia gamma di effetti subletali ,comportamentali e alterazioni fisiologiche sia in api che in altri artropodi utili [9].Gli effetti negativi usualmente prodotti da un fitofarmaco sono limitati dall’azione di di diversi enzimi metabolici. Benchè le api abbiano un minor numero di geni che sono competenti per le attività di detossificazione rispetto ad altri insetti [10] non sono per forza di cose più sensibili ai pesticidi [11].Nelle api i processi di detossificazione avvengono principalmente nello stomaco e nei corpi grassi[12] [13].
Da questo consegue che cambiamenti nell’attività dei sistemi di detossificazione possono condurre a variazione di sensibilità ai pesticidi e più generalmente ad alterazioni della loro omeostasi fisiologica.
I Parassiti possono anche loro influire sulla omeostasi dell’insetto e svilupparsi.Questo spesso porta a cambiamenti nello sviluppo dell’insetto ,nel comportamento,nella riproduzione e nella tolleranza ai parassiti. Cambiamenti fisiologici prodotti dal parassitismo possono rendere gli insetti più sensibili agli stress ambientali e possono provocarne una diminuzione del benessere [15].Questo concetto è alle fondamenta delle strategie di lotta integrata che prevedono l’uso di parassiti entomopatogeni associati a basse dosi di fitofarmaco [16]–[18]. Le api sono anch’esse vittime di questi effetti congiunti .
Potenziali interazioni tra Nosema e pesticidi sono state descritte da Ladas già nel 1972 [19].Successivamente , Alaux et al.hanno mostrato che la coesposizione al Nosema e a imidacloprid indebolisce l’ape [20]. Questo risultato rafforza l’ipotesi di cause multifattoriali nelle consistenti perdite di api osservate nel mondo.
Due specie di microsporidio, Nosema apis e Nosema ceranae, sono agenti delle due maggiori patologie conosciute come nosemiasi A e C [21].Entrambe le specie sono parassiti intracellulari obbligati delle api adulte. N. ceranae aumenta la domanda energetica dell’ape [20], [22] e diminuisce il livello di zuccheri nell’emolinfa [23]. In aggiunta l’infezione da N. ceranae sopprime significativamente la risposta immunitaria dell’ape [20], [24] e aumenta la produzione di etiloleato [25]. Poi , le api infette da N. ceranae sono caratterizzate da una aspettativa di vita più corta rispetto alle api non infette [20], [26].
Non esistono dati sugli effetti di N. ceranae sul sistema di detossificazione delle api.Di conseguenza non è possibile valutare il rapporto tra infezione da N. ceranae e capacità di detossificazione di api infette e loro sensibilità ai pesticidi.
Si può ipotizzare che il sistema di detossificazione possa essere modificato dall’infezione di Nosema dal momento che in maggior misura la detossificazione avviene nello stomaco e che questi tessuti sono il sito di proliferazione del N. ceranae. In questo lavoro abbiamoverificato l’impatto del N. ceranae sulle attività di detossificazione dell’ape e la loro sensibilità a fipronil (phenylpyrazole) e thiacloprid (neonicotinoid), due pesticidi rinvenuti in consistenti quantità negli alveari [3]. Le loro LD50, fipronil (LD50: 4.17 ng/ape) e thiacloprid (LD50: 17 µg/ape) sono considerate rispettivamente altamente e leggermente tossiche per le api[27]. Dimostriamo , comunque, che una esposizione giornaliera a concentrazioni di 1/100 della LD50 producono un significativo effetto di aumento di mortalità delle api precedentemente infettate da N. ceranae.
Discussione
Questo lavoro dimostra che dosi sub letali di un neonicotinoide (thiacloprid) e di un fenilpirazolo (fipronil) aumentano consistentemente la mortalità di api precedentemente infettate da N. ceranae. Sebbene i meccanismi esatti di questa sinergia rimangano non chiari , i dati suggeriscono che il processo di sensibilizzazione non è fortemente collegato ad una diminuzione della capacità di detossificazione delle api infette da nosema o necessariamente ad un aumento della proliferazione di N. ceranae dopo esposizione all’insetticida.
Durante il nostro esperimento non è stata osservata mortalità di api a 10 giorni dopo l’infezione . Numerosi foci erano visibili nelle cellule epiteliali delle api e una media di 18.4.106 (±0.4.106) spore/ape è stata misurata nel tratto digestivo.
Dopo 10 giorni dall’infezione , possiamo considerare che le api infette del nostro studio mostrino un livello di invasione di N. ceranae simile a quanto osservato nelle bottinatrici da altre ricerche .La prima evidenza di sinergia tra Nosema e esposizione a insetticidi nelle api è stata prodotta da Alaux et al. [2010]. Questi autori hanno dimostrato che il trattamento con Nosema combinato a esposizione a imidacloprid,un altro neonicotinoide, risulta in un’alta mortalità di api. Basandoci su questi risultati abbiamo ipotizzato che l’infezione da N. ceranae possa alterare il funzionamento del sistema di detossificazione .Abbiamo misurato i sistemi ECOD e GST per valutare la loro attività e poter testare questa ipotesi. Negli insetti ,l’attività di ECOD e GST è spesso servita come misura dell’attività degli enzimi d metabolizzazione. In aggiunta, i livelli di attività di ECOD e GST sono stati associati alla sensibilità agli insetticidi. I risultati mostrano che l’attività di ECOD non subisce variazioni nei 10 giorni successivi all’infezione da nosema nei corpi grassi e nello stomaco mentre l’attività di GST aumenta significativamente in entrambi i tessuti.Perciò questi dati indicano che l’alta mortalità osservata dopo l’esposizione all’ insetticida delle api precedentemente infettate da N. ceranae non è fortemente collegata a diminuzione delle capacità di detossificazione. Tuttavia non possiamo escludere che l’infezione da N. ceranae possa modificare la produzione di altri enzimi coinvolti nella detossificazione di questi insetticidi. L’esposizione a dosi subletali di fipronil e thiacloprid aumenta la mortalità di api infettate da N. ceranae. Si consideri che nella nostra procedura sperimentale, a 10 giorni dall’infezione le api sono state esposte in maniera cronica a quantità molto basse di insetticida per 10 giorni.
Il consumo di Fipronil non è risultato differente fra api infette e non infette con una media corrispondente ad una esposizione equivalente alla LD50/158 (25.3±4.8 pg/bee) per le api non infette e LD50/148 (26.9±0.8 pg/bee) per api infette Una simile esposizione è stata considerata subletale da Aliouane et al. [35]. Alla stessa maniera le api esposte a thiacloprid hanno consumato una quantità giornaliera similare equivalente alla LD50/151 (112.1±4.4 ng/bee) per non infette e LD50/112 (152.8±8.7 ng/bee) per infette. Come supposto , questi livelli di esposizione di fipronil e thiacloprid non hanno nessun effetto sulla mortalità delle api non infette da nosema e neppure sul loro comportamento.
Gli stessi livelli di esposizione di api infette da nosema causano sintomi di avvelenamento e aumentano la mortalità .
Non essendo riusciti a spiegare il fenomeno sulla base del metabolismo di detossificazione,siamo passati a studiare l’effetto dell’esposizione agli insetticidi sulla produzione di spore .
I risultati indicano che l’esposizione a fipronil ha un effetto antagonista sulla produzione di spore . Infatti , in comparazione con api infettate non esposte all’insetticida,la produzione di spore risulta diminuire del 33% durante l’esposizione a fipronil . Invece la produzione di spore aumenta del 40% con esposizione a thiacloprid. Questi risultati non spiegano l’aumento di mortalità osservato in presenza di insetticidi. Primariamente ,l’esposizione a fipronil e thiacloprid induce un aumento di mortalità nelle api infette da nosema ,ma ha un effetto opposto sulla produzione di spore di nosema . Secondariamente , nel caso di thiacloprid,la maggior produzione di spore non sembra sufficiente a spiegare l’aumento di mortalità di api .
L’effetto di interazione osservato tra N. ceranae e insetticidi sulla mortalità di api è in sintonia con le osservazioni in api infette da Nosema sp e esposte a imidacloprid [20]. Tuttavia, mentre l’effetto sinergico descrito da Alaux et al. [20] sembra collegato ad un aumento di consumo di imidacloprid da parte delle api infette da nosema,l’effetto sinergico osservato nel nostro studio ,comunque, non è dovuto ad un aumento della quantità di alimentazione assunta dopo l’infezione. Questi nuovi dati sull ‘azione sinergica di Nosema e insetticidi mette in luce che questo tipo di interazioni ( fitofarmaco-patogeno ndt) non sono ristrette ai neonicotinoidi (imidacloprid, thiacloprid) ,ma estese ad altre classi di insetticidi, inclusi fenilpirazoli.
Una ulteriore generalizzazione di questo fenomeno in api esposte ad altri insetticidi non sarebbe sorprendente.
Alcune categorie di insetticidi chimici hanno già mostrato adeguato potenziale per interagire in maniera sinergica con funghi entomopatogenici in altre specie di insetti. Questi tipo di combinazioni sono comunemente usate in lotta integrata perchè vi è un effetto di contrasto alla formazione di resistenze agli insetticidi in molti insetti [36] ed è in questo modo possibile la riduzione della dose di insetticida immesso nell’ambiente [16], [37], [38]. Per esempio, composti organofosforici (oxydemeton methyl) e piretrinoïdi (permethrin) usati in combinazione con Beauvaria bassiana, inducono un maggiore impatto su Spilarctia obliqua [39] e Anopheles gambiae [36] rispetto a quanto prodotto dal solo agente di controllo.In generale ,l’effetto sinergico di queste combinazioni appare a dosi di insetticida considerate subletali per l’insetto ( bersaglio ) [17], [40].
Nel nostro studio, il maggior effetto osservato con queste combinazioni include un aumento della tossicità dell’insetticida (diminuzione di LD50 o LC50) e una diminuzione del tempo necessario a produrre la morte dell’insetto ( ape) . Questo suggerisce che la suscettibilità degli insetti ai pesticidi sia un fenomeno più complesso di quanto fino ad ora pensato. L’influenza di parassitismo nell’ecosistema deve esser presa in considerazione negli studi tossicologici.Come mostrato nel nostro studio ,l’uso della LD50 come indicatore della tossicità di insetticida sistemico porta ad una sottostima degli effetti deleteri indotti in api infette ( da nosema ceranae) .
Certamente, abbiamo dimostrato che dosi subletali di insetticida hanno un alto impatto sulla mortalità di api infette da Nosema. Questa precauzione è importante dal momento che N. ceranae si diffonde rapidamente e può colpire più del 80% delle famiglie di api [41].
Numerosi esempi di interazione tra prodotti chimici e patogeni che affliggono gli insetti sono stati descritti [15], [17], [39], [42]–[44]. Sfortunatamente, i meccanismi fisiologici coinvolti in queste interazioni permangono scarsamente compresi e possono apparire contraddittori.
Una delle correnti ipotesi suggerisce che metaboliti del patogeno possano interferire coi processi di detossificazione [36], [45]. Una diversa assegnazione degli enzimi di detossificazione degli insettici , una parte dei quali viene utilizzato per contrastare lo sviluppo del patogeno , potrebbe ridurre la quantità di enzimi disponibili per la neutralizzazione dell’insetticida col risultato di un cambiamento della tossicocinetica . Pertanto, è possibile che gli effetti sinergici risultino in un effettivo aumento della sensibilità agli insetticidi in presenza di infezione di un parassita proliferante.
Ironicamente, i pochi dati pubblicati relativamente agli effetti di parassitismo sugli enzimi di metabolizzazione degli insetti mostrano che un largo insieme di infezioni parassitarie possono attivare diverse proteine implicate nella detossificazione (esempi- CYP's, GST, esterasi) [45]–[50].
In maniera consistente dimostriamo nel nostro studio che 10 giorni dopo l’infezione da N. ceranae, l’attività di GST aumenta sia nello stomaco che nei corpi grassi dell’ape, in accordo con l’aumento di attività antiossidante recentemente descritta in regine infette da Nosema[51]. Questo risultato contrasta con l’aumento di di suscettibilità agli insetticidi delle api infette da nosema suggerendo che GST possa non essere coinvolto nei processi di detossificazione di fipronil e thiacloprid. Comunque, la produzione di monoossigenasi microsomale è un processo inducibile [52] e rimane possibile che induzione di detossificazione in risposta a esposizione a insetticidi sia impedita dall’infezione da Nosema. Di modo che le api non infette sono in grado di rispondere agli insetticidi aumentando i processi di detossificazione mentre le api infette da nosema non possono. Questo potrebbe spiegare i sintomi di intossicazione osservati nelle api infette.
Curiosamente , in molti studi sugli effetti sinergici di funghi e insetticidi.l’impatto dell’esposizione agli insetticidi sulla virulenza del parassita non viene investigata [36], [39], [40], [43]. Nei rari studi che considerano questo aspetto, la virulenza del parassita non è aumentata dal parassita. Al contrario,malgrado l’effetto sinergico sulla mortalità di insetti, risulta che l’esposizione agli insetticidi tende a diminuire germinazione o proliferazione del fungo [44]. Sicuramente gli insetticidi hanno il potenziale per agire sui vari stadi di sviluppo dei funghi entomopatogeni [18], [53], [54] e giustificare perchè studi di compatibilità tra parassiti e insetticidi sono importanti per lo sviluppo di strategie di lotta integrata. Nel nostro studio , fipronil e thiacloprid hanno effetto antagonista sulla proliferazione di N. ceranae con fipronil che diminuisce leggermente la produzione di spore nello stomaco dell’ape.L’effetto può essere attributo sia all’effetto citotossico del fipronil sull’epitelio intestinale [55], [56] che alla sua azione pro-ossidante [57] che può influire sul ciclo di riproduzione di N. ceranae, ma queste asserzioni devono essere confermate con altri esperimenti. In contrasto, thiacloprid aumenta la produzione di spore nel nostro studio.Questo risultato non è concorde con le osservazioni di Alaux et al. [20] che mostrano che imidacloprid diminuisce leggermente la produzione di spore nello stomaco dell’ ape. Così, nel nostro studio l’effetto sinergico dell’infezione da N. ceranae e l’esposizione all’insetticida non appare correlata ad aumento di virulenza del N. ceranae in conseguenza della presenza di insetticidi.
Per concludere, il nostro studio conferma che l’interazione tra N. ceranae e insetticidi costituisce un significativo rischio per la salute delle api. L’aumentare della prevalenza (presenza ndt ) del N. ceranae in Europa in combinazione con la costante pressione tossica che le api devono subire,sembra contribuire allo spopolamento delle famiglie.
Una miglior comprensione degli effetti fisiologici indotti da basse quantità di pesticidi e infezione da Nosema sembra essenziale per chiarire l’effetto sinergico osservato relativamente alla mortalità di api. La scoperta di molecole e meccanismi cellulari coinvolti in questi effetti avversi indotti da patogeno e pesticidi potrebbe confermare l’influenza di questi elementi di stress sulla salute delle api In aggiunta ,questi dati offrono informazioni aggiuntive che consentono una migliore valutazione dei rischi associati a questi elementi stressanti mettendo in luce l’urgente necessità di medicinali veterinari per il trattamento del nosema.
